2 × Pfu PCR Mix

Plantilla A-1

■ La plantilla conté impureses de proteïnes o inhibidors de Taq, etc. —Purifiqueu la plantilla d’ADN, elimineu les impureses de proteïnes o extraieu l’ADN de la plantilla amb kits de purificació.

■ La desnaturalització de la plantilla no està completa: augmentar adequadament la temperatura de desnaturalització i allargar el temps de desnaturalització.

■ Degradació de la plantilla: preparar de nou la plantilla.

A-2 Primer

■ Mala qualitat dels primers: —Resintetitzeu el primer.

■ Degradació del cebador ——Aliquot els primers d’alta concentració en petit volum per a la seva conservació. Eviteu la congelació i descongelació múltiples o crioconservació a llarg termini de 4 ° C.

■ Disseny inadequat d’imprimacions (per exemple, la longitud de l’imprimació no és suficient, dímer format entre imprimacions, etc.) -Imprimacions de redisseny (evitar la formació de dímers d’imprimació i estructura secundària)

A-3 Mg²⁺concentració

■ Mg²⁺ la concentració és massa baixa —— Increment adequat de Mg²⁺ concentració: Optimitzar el Mg²⁺ concentració per una sèrie de reaccions d’1 mM a 3 mM amb un interval de 0,5 mM per determinar el Mg òptim²⁺ concentració per a cada plantilla i imprimació.

A-4 Temperatura de recuit

■ L'alta temperatura de recuit afecta la unió de la imprimació i la plantilla. —— Reduïu la temperatura de recuit i optimitzeu l’estat amb un gradient de 2 ° C.

A-5 Temps d’ampliació

■ Temps d'extensió curt: augmentar el temps d'extensió.

Fenòmens: les mostres negatives també mostren les bandes de seqüència objectiu.

A-1 Contaminació de PCR

■ Contaminació creuada de la seqüència diana o dels productes d'amplificació —— No pipeteu amb precaució la mostra que conté la seqüència diana a la mostra negativa ni vesseu-la del tub de la centrífuga. Els reactius o equips s’han d’autoclavar per eliminar els àcids nucleics existents i s’ha de determinar l’existència de contaminació mitjançant experiments de control negatiu.

■ Contaminació dels reactius ——Aliquoteu els reactius i guardeu-los a baixa temperatura.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ la concentració és massa baixa —— Increment adequat de Mg²⁺ concentració: Optimitzar el Mg²⁺ concentració per una sèrie de reaccions d’1 mM a 3 mM amb un interval de 0,5 mM per determinar el Mg òptim²⁺ concentració per a cada plantilla i imprimació.

■ Disseny incorrecte de la imprimació i la seqüència objectiu té homologia amb la seqüència no objectiu. —— Re-disseny de primers.

Fenòmens: les bandes d'amplificació per PCR són incompatibles amb la mida esperada, ja sigui gran o petita, o de vegades es produeixen bandes d'amplificació específiques i bandes d'amplificació no específiques.

A-1 Primer

■ Poca especificitat de la imprimació

—— Imprimació de redisseny.

■ La concentració d’imprimació és massa elevada: augmenta adequadament la temperatura de desnaturalització i allarga el temps de desnaturalització.

A-2 Mg²⁺ concentració

■ El Mg²⁺ la concentració és massa elevada ——Reduïu adequadament la concentració de Mg2 +: optimitzeu el Mg²⁺ concentració per una sèrie de reaccions d’1 mM a 3 mM amb un interval de 0,5 mM per determinar el Mg òptim²⁺ concentració per a cada plantilla i imprimació.

A-3 Polimerasa termoestable

■ Quantitat d’enzim excessiu —— Reduïu adequadament la quantitat d’enzim a intervals de 0,5 U.

A-4 Temperatura de recuit

■ La temperatura de recuit és massa baixa: augmenta adequadament la temperatura de recuit o adopta el mètode de recuit de dues etapes

A-5 cicles de PCR

■ Hi ha massa cicles de PCR —— Reduïu el nombre de cicles de PCR.

A-1 Primer——Preca especificitat ——Rediseu la imprimació, canvieu la posició i la longitud de la imprimació per millorar la seva especificitat; o realitzar PCR imbricada.

A-2 Plantilla ADN

——La plantilla no és pura ——Purifiqueu la plantilla o extracteu l’ADN amb kits de purificació.

A-3 Mg²⁺ concentració

——Mg²⁺ la concentració és massa elevada ——Reduïu adequadament Mg²⁺ concentració: Optimitzar el Mg²⁺ concentració per una sèrie de reaccions d’1 mM a 3 mM amb un interval de 0,5 mM per determinar el Mg òptim²⁺ concentració per a cada plantilla i imprimació.

A-4 dNTP

——La concentració de dNTP és massa alta ——Reduïu adequadament la concentració de dNTP

A-5 Temperatura de recuit

——Temperatura de recuit massa baixa—— Augmenteu adequadament la temperatura de recuit

Cicles A-6

——Massa cicles ——Optimitzeu el nombre de cicles

El primer pas és triar la polimerasa adequada. La polimerasa Taq regular no es pot revisar a causa de la manca d'activitat d'exonucleasa de 3'-5 ', i el desajust reduirà considerablement l'eficiència de l'extensió dels fragments. Per tant, la polimerasa Taq regular no pot amplificar eficaçment fragments diana de més de 5 kb. La polimerasa Taq amb modificacions especials o una altra polimerasa d'alta fidelitat s'ha de seleccionar per millorar l'eficiència de l'extensió i satisfer les necessitats d'amplificació de fragments llargs. A més, l’amplificació de fragments llargs també requereix un ajust corresponent del disseny de la imprimació, el temps de desnaturalització, el temps d’extensió, el pH de la memòria intermèdia, etc. Per evitar danys a la plantilla, el temps de desnaturalització a 94 ° C s’ha de reduir a 30 segons o menys per cicle i el temps d’elevació de la temperatura a 94 ° C abans de l’amplificació ha de ser inferior a 1 min. A més, establir la temperatura d’extensió a uns 68 ° C i dissenyar el temps d’extensió segons la velocitat d’1 kb / min pot garantir una amplificació efectiva de fragments llargs.

La taxa d'error d'amplificació per PCR es pot reduir mitjançant l'ús de diverses ADN polimerases amb alta fidelitat. Entre totes les ADN polimerases de Taq trobades fins ara, l’enzim Pfu té la taxa d’error més baixa i la fidelitat més alta (vegeu la taula adjunta). A més de la selecció d’enzims, els investigadors poden reduir encara més la velocitat de mutació de la PCR optimitzant les condicions de reacció, inclosa l’optimització de la composició del tampó, la concentració de polimerasa termoestable i l’optimització del nombre de cicles de PCR.