Kit ràpid de mutagènesi dirigit al lloc

Mutació ràpida en un lloc o en diversos llocs en el gen diana del vector diana.

La mutagènesi in vitro dirigida al lloc és un important mètode experimental en diversos camps de la biologia i la medicina, que s’utilitza principalment per modificar i optimitzar gens objectiu, explorar els llocs reguladors dels promotors, així com estudiar la complexa relació entre l’estructura i la funció de les proteïnes. El kit adopta la tecnologia líder actual per dur a terme directament una mutació en un lloc, una mutació en diversos llocs, així com una inserció o una supressió en el gen diana. La taxa de mutació de la mutació en un sol lloc pot arribar a superar el 90%. A més, a diferència dels kits de mutació tradicionals que requereixen diverses rondes de PCR, sub-clonació i altres passos que requereixen temps i molta feina, el funcionament del kit és més senzill i només es necessiten quatre passos per construir la soca mutant.

Gat. No Mida de l’embalatge
44992901 20 rxn

 

 


Detall del producte

Preguntes freqüents

Etiquetes de producte

Característiques

■ Senzill i ràpid: el kit adopta la tecnologia d'amplificació de plàsmids de substitució sense cadenes. Només necessiten 4 passos per realitzar la transformació de soca de tipus salvatge a soca mutant, sense els passos que requereixen temps i molta feina, com ara múltiples rondes de PCR i sub-clonació.
■ Imprimació d'alta eficiència: el kit adopta el principi del disseny d'imprimació parcialment superposat, de manera que es poden obtenir més plasmidis mutants mitjançant l'amplificació.
■ Àmpliament aplicable: el kit no només pot realitzar mutacions en un lloc, sinó també mutacions en diversos llocs. Pot mutar fins a 5 llocs.
■ Fàcil adaptabilitat: el kit pot realitzar mutacions dirigides al lloc en plasmidis amb una mida màxima de 10 kb, que cobreixen bàsicament tots els plasmidis d'ús comú.
■ Alta taxa de mutació: el kit té la funció de doble digestió de plantilles de plasmidi metilat in vitro i in vivo, garantint una taxa de mutació més alta.

Configuració de la reacció de mutació del lloc i programa de PCR

■ Per a la mutació multi-lloc d'un primer primer, la taxa de mutació serà inferior a la de la mutació d'un lloc a causa de l'augment del nombre de llocs de mutació. Segons les nostres dades experimentals, quan el nombre de llocs de mutació arribi a 5, la taxa de mutació positiva es reduirà al 50%. Per tant, en aquest cas, es recomana augmentar el nombre de clons verificats.
■ El kit admet mutació multi-primer multi-lloc, de manera que es poden dur a terme experiments de mutació simultàniament en una gamma més àmplia de gens. El límit superior del nombre de llocs de mutació és encara de 5.
■ Es recomana aplicar els plàsmids control i els primers proporcionats al kit quan es duguin a terme nous experiments de mutació per facilitar l'anàlisi de problemes experimentals.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

Tots els productes es poden personalitzar per ODM / OEM. Per obtenir més informació,feu clic a Servei personalitzat (ODM / OEM)


  • Anterior:
  • Pròxim:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    P: No hi ha bandes d'amplificació

    Plantilla A-1

    ■ La plantilla conté impureses de proteïnes o inhibidors de Taq, etc. —Purifiqueu la plantilla d’ADN, elimineu les impureses de proteïnes o extraieu l’ADN de la plantilla amb kits de purificació.

    ■ La desnaturalització de la plantilla no està completa: augmentar adequadament la temperatura de desnaturalització i allargar el temps de desnaturalització.

    ■ Degradació de la plantilla: preparar de nou la plantilla.

    A-2 Primer

    ■ Mala qualitat dels primers: —Resintetitzeu el primer.

    ■ Degradació del cebador ——Aliquot els primers d’alta concentració en petit volum per a la seva conservació. Eviteu la congelació i descongelació múltiples o crioconservació a llarg termini de 4 ° C.

    ■ Disseny inadequat d’imprimacions (per exemple, la longitud de l’imprimació no és suficient, dímer format entre imprimacions, etc.) -Imprimacions de redisseny (evitar la formació de dímers d’imprimació i estructura secundària)

    A-3 Mg2+concentració

    ■ Mg2+ la concentració és massa baixa —— Increment adequat de Mg2+ concentració: Optimitzar el Mg2+ concentració per una sèrie de reaccions d’1 mM a 3 mM amb un interval de 0,5 mM per determinar el Mg òptim2+ concentració per a cada plantilla i imprimació.

    A-4 Temperatura de recuit

    ■ L'alta temperatura de recuit afecta la unió de la imprimació i la plantilla. —— Reduïu la temperatura de recuit i optimitzeu l’estat amb un gradient de 2 ° C.

    A-5 Temps d’ampliació

    ■ Temps d'extensió curt: augmentar el temps d'extensió.

    P: Fals positiu

    Fenòmens: les mostres negatives també mostren les bandes de seqüència objectiu.

    A-1 Contaminació de PCR

    ■ Contaminació creuada de la seqüència diana o dels productes d'amplificació —— No pipeteu amb precaució la mostra que conté la seqüència diana a la mostra negativa ni vesseu-la del tub de la centrífuga. Els reactius o equips s’han d’autoclavar per eliminar els àcids nucleics existents i s’ha de determinar l’existència de contaminació mitjançant experiments de control negatiu.

    ■ Contaminació dels reactius ——Aliquoteu els reactius i guardeu-los a baixa temperatura.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ la concentració és massa baixa —— Increment adequat de Mg2+ concentració: Optimitzar el Mg2+ concentració per una sèrie de reaccions d’1 mM a 3 mM amb un interval de 0,5 mM per determinar el Mg òptim2+ concentració per a cada plantilla i imprimació.

    ■ Disseny incorrecte de la imprimació i la seqüència objectiu té homologia amb la seqüència no objectiu. —— Re-disseny de primers.

    P: Amplificació no específica

    Fenòmens: les bandes d'amplificació per PCR són incompatibles amb la mida esperada, ja sigui gran o petita, o de vegades es produeixen bandes d'amplificació específiques i bandes d'amplificació no específiques.

    A-1 Primer

    ■ Poca especificitat de la imprimació

    —— Imprimació de redisseny.

    ■ La concentració d’imprimació és massa elevada: augmenta adequadament la temperatura de desnaturalització i allarga el temps de desnaturalització.

    A-2 Mg2+ concentració

    ■ El Mg2+ la concentració és massa elevada ——Reduïu adequadament la concentració de Mg2 +: optimitzeu el Mg2+ concentració per una sèrie de reaccions d’1 mM a 3 mM amb un interval de 0,5 mM per determinar el Mg òptim2+ concentració per a cada plantilla i imprimació.

    A-3 Polimerasa termoestable

    ■ Quantitat d’enzim excessiu —— Reduïu adequadament la quantitat d’enzim a intervals de 0,5 U.

    A-4 Temperatura de recuit

    ■ La temperatura de recuit és massa baixa: augmenta adequadament la temperatura de recuit o adopta el mètode de recuit de dues etapes

    A-5 cicles de PCR

    ■ Hi ha massa cicles de PCR —— Reduïu el nombre de cicles de PCR.

    P: Bandes desiguals o desprestigiades

    A-1 Primer——Preca especificitat ——Rediseu la imprimació, canvieu la posició i la longitud de la imprimació per millorar la seva especificitat; o realitzar PCR imbricada.

    A-2 Plantilla ADN

    ——La plantilla no és pura ——Purifiqueu la plantilla o extracteu l’ADN amb kits de purificació.

    A-3 Mg2+ concentració

    ——Mg2+ la concentració és massa elevada ——Reduïu adequadament Mg2+ concentració: Optimitzar el Mg2+ concentració per una sèrie de reaccions d’1 mM a 3 mM amb un interval de 0,5 mM per determinar el Mg òptim2+ concentració per a cada plantilla i imprimació.

    A-4 dNTP

    ——La concentració de dNTP és massa alta ——Reduïu adequadament la concentració de dNTP

    A-5 Temperatura de recuit

    ——Temperatura de recuit massa baixa—— Augmenteu adequadament la temperatura de recuit

    Cicles A-6

    ——Massa cicles ——Optimitzeu el nombre de cicles

    P: Quant ADN de plantilla s'ha d'afegir en un sistema de reacció de PCR de 50 μl?
    ytry
    P: Com amplificar fragments llargs?

    El primer pas és triar la polimerasa adequada. La polimerasa Taq regular no es pot revisar a causa de la manca d'activitat d'exonucleasa de 3'-5 ', i el desajust reduirà considerablement l'eficiència de l'extensió dels fragments. Per tant, la polimerasa Taq regular no pot amplificar eficaçment fragments diana de més de 5 kb. La polimerasa Taq amb modificacions especials o una altra polimerasa d'alta fidelitat s'ha de seleccionar per millorar l'eficiència de l'extensió i satisfer les necessitats d'amplificació de fragments llargs. A més, l’amplificació de fragments llargs també requereix un ajust corresponent del disseny de la imprimació, el temps de desnaturalització, el temps d’extensió, el pH de la memòria intermèdia, etc. Per evitar danys a la plantilla, el temps de desnaturalització a 94 ° C s’ha de reduir a 30 segons o menys per cicle i el temps d’elevació de la temperatura a 94 ° C abans de l’amplificació ha de ser inferior a 1 min. A més, establir la temperatura d’extensió a uns 68 ° C i dissenyar el temps d’extensió segons la velocitat d’1 kb / min pot garantir una amplificació efectiva de fragments llargs.

    P: Com millorar la fidelitat d'amplificació de la PCR?

    La taxa d'error d'amplificació per PCR es pot reduir mitjançant l'ús de diverses ADN polimerases amb alta fidelitat. Entre totes les ADN polimerases de Taq trobades fins ara, l’enzim Pfu té la taxa d’error més baixa i la fidelitat més alta (vegeu la taula adjunta). A més de la selecció d’enzims, els investigadors poden reduir encara més la velocitat de mutació de la PCR optimitzant les condicions de reacció, inclosa l’optimització de la composició del tampó, la concentració de polimerasa termoestable i l’optimització del nombre de cicles de PCR.

    Escriviu aquí el vostre missatge i envieu-nos-el