Adaptador d'índex únic TIANSeq (Illumina)

Actualment, la tecnologia de seqüenciació d’alt rendiment es basa principalment en la tecnologia de seqüenciació d’última generació. Com que la durada de lectura de la tecnologia de seqüenciació de la propera generació és limitada, hem de dividir la seqüència de longitud completa en petites biblioteques de fragments per seqüenciar-les. Segons les necessitats de diferents experiments de seqüenciació, normalment escollim seqüenciació simple o doble. Actualment, els fragments d'ADN de la biblioteca de seqüenciació de la propera generació es distribueixen generalment en el rang de 200-800 pb.

a) L’ADN és de baixa qualitat i conté inhibidors. Utilitzeu mostres d’ADN d’alta qualitat per evitar la inhibició de l’activitat enzimàtica.

b) La quantitat de mostra d'ADN és insuficient quan s'utilitza el mètode lliure de PCR per construir una biblioteca d'ADN. Quan l’entrada de l’ADN fragmentat supera els 50 ng, es pot realitzar un flux de treball lliure de PCR durant el procés de construcció de la biblioteca. Si el número de còpia de la biblioteca és massa baix per ser seqüenciada directament, la biblioteca d’ADN es pot ampliar mitjançant PCR després del lligament de l’adaptador.

c) La contaminació per ARN condueix a una quantificació inicial d’ADN inexacta Pot existir contaminació per ARN en el procés de purificació de l’ADN genòmic, que pot provocar una quantificació d’ADN inexacta i una càrrega insuficient d’ADN durant la construcció de la biblioteca. L’ARN es pot eliminar mitjançant el tractament amb RNasa.

A-1

a) Apareixen fragments petits (60 pb-120 pb) Els fragments petits solen ser fragments adaptadors o dímers formats per adaptadors. La purificació amb comptes magnètics Agencourt AMPure XP pot eliminar eficaçment aquests fragments d'adaptador i garantir la qualitat de la seqüenciació.

b) Apareixen fragments grans a la biblioteca després de l'amplificació per PCR. La mida del fragment d'ADN de la biblioteca augmentarà en 120 pb després de lligar l'adaptador. Si el fragment d'ADN augmenta més de 120 pb després del lligament de l'adaptador, pot ser causat per l'amplificació anormal del fragment d'una amplificació PCR excessiva. Reduir el nombre de cicles de PCR pot evitar la situació.

c) Mida anormal dels fragments d'ADN de la biblioteca després del lligament de l'adaptador La longitud de l'adaptador d'aquest kit és de 60 pb. Quan els dos extrems del fragment estan lligats als adaptadors, la longitud només augmentarà 120 pb. Si utilitzeu un adaptador diferent del proporcionat per aquest kit, poseu-vos en contacte amb el proveïdor per proporcionar informació rellevant, com ara la longitud de l'adaptador. Assegureu-vos que el flux de treball i l'operació de l'experiment segueixin els passos descrits al manual.

d) Mida del fragment d’ADN anormal abans de la lligadura de l’adaptador El motiu d’aquest problema pot ser causat per condicions de reacció incorrectes durant la fragmentació de l’ADN. S'han d'utilitzar diferents temps de reacció per a diferents aportacions d'ADN. Si l’entrada d’ADN és superior a 10 ng, es recomana escollir el temps de reacció de 12 min com a temps d’inici de l’optimització i la mida del fragment produït en aquest moment es troba principalment entre 300-500 pb. Els usuaris poden augmentar o disminuir la longitud dels fragments d’ADN durant 2-4 min segons els seus propis requisits per optimitzar els fragments d’ADN amb la mida necessària.

A-2

a) El temps de fragmentació no s’optimitza Si l’ADN fragmentat és massa petit o massa gran, consulteu les Directrius per a la selecció del temps de fragmentació que es proporcionen a la instrucció per determinar el temps de reacció i utilitzeu aquest punt de temps com a control. sistema de reacció per allargar o escurçar 3 min per fer un ajust més precís en el temps de fragmentació.

A-3

Distribució anormal de la mida de l’ADN després del tractament de fragmentació

a) Mètode de descongelació incorrecte del reactiu de fragmentació o el reactiu no es barreja completament després del descongelament. Descongeleu el reactiu de barreja d’enzims de fragmentació 5 × sobre gel. Un cop descongelat, barregeu el reactiu uniformement fent un cop suau al fons del tub. No gireu amb el reactiu.

b) La mostra d’entrada d’ADN conté EDTA o altres contaminants L’esgotament d’ions de sal i agents quelants a l’etapa de purificació de l’ADN és particularment important per a l’èxit de l’experiment. Si l'ADN es dissol en 1 × TE, utilitzeu el mètode proporcionat a la instrucció per realitzar la fragmentació. Si la concentració d'EDTA a la solució és incerta, es recomana purificar l'ADN i dissoldre'l en aigua desionitzada per a la seva posterior reacció.

c) Quantificació inicial d’ADN inexacta La mida de l’ADN fragmentat està estretament relacionada amb la quantitat d’entrada d’ADN. Abans del tractament de fragmentació, és essencial quantificar amb precisió l’ADN mitjançant Qubit, Picogreen i altres mètodes per determinar la quantitat exacta d’ADN al sistema de reacció.

 d) La preparació del sistema de reacció no segueix les instruccions. La preparació del sistema de reacció fragmentada s’ha de dur a terme sobre gel estrictament d’acord amb les instruccions. Per garantir el millor efecte, tots els components de la reacció s’han de col·locar sobre gel i la preparació del sistema de reacció s’ha de dur a terme després del refredament complet. Un cop finalitzada la preparació, llisqueu o pipeteu per barrejar bé. No vòrtex!

1. Un mètode de mescla inadequat (vòrtex, oscil·lació violenta, etc.) provocarà una distribució anormal dels fragments de la biblioteca (tal com es mostra a la figura següent), afectant així la qualitat de la biblioteca. Per tant, quan prepareu la solució de reacció de la barreja de fragmentació, pipeteu suaument cap amunt i cap avall per barrejar, o utilitzeu la punta del dit per lliscar i barrejar uniformement. Aneu amb compte de no barrejar-vos amb el vòrtex.

2. S'ha d'utilitzar ADN d'alta puresa per a la construcció de biblioteques

■ Bona integritat de l'ADN: la banda d'electroforesi supera els 30 kb, sense restes

■ OD260 / 230:> 1,5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. La quantitat d'entrada d'ADN ha de ser exacta. Es recomana utilitzar mètodes Qubit i PicoGreen per quantificar l'ADN, en lloc de Nanodrop.

4. Cal determinar el contingut d’EDTA en solució d’ADN L’EDTA té una gran influència en la reacció de fragmentació. Si el contingut d’EDTA és elevat, s’ha de realitzar una purificació d’ADN abans de la prova posterior.

5. La solució de reacció de fragmentació s'ha de preparar sobre gel. El procés de fragmentació és sensible a la temperatura i al temps de reacció (especialment després d'afegir un potenciador). Per assegurar la precisió del temps de reacció, prepareu el sistema de reacció sobre gel.

6. El temps de reacció de fragmentació ha de ser precís. El temps de reacció del pas de fragmentació afectarà directament la mida dels productes del fragment, afectant així la distribució de la mida dels fragments d'ADN a la biblioteca.

1. Quin tipus de mostra és aplicable a aquest kit?

El tipus de mostra aplicable d’aquest kit pot ser ARN total o ARNm purificat amb bona integritat de l’ARN. Si s'utilitza ARN total per construir la biblioteca, es recomana utilitzar el kit d'esgotament d'ARNr (Cat # 4992363/4992364/4992391) per eliminar primer l'ARNr.

2. Es poden utilitzar mostres FFPE per construir biblioteca amb aquest kit?

L'ARNm de les mostres de FFPE es degradarà fins a cert punt, amb una relativa integritat pobra. En utilitzar aquest kit per a la construcció de la biblioteca, es recomana optimitzar el temps de fragmentació (escurçar el temps de fragmentació o no realitzar fragmentació).

3. Amb el pas de selecció de mides que es proporciona al manual del producte, què pot fer que el segment inserit aparegui una lleugera desviació?

La selecció de la mida es realitzarà d’acord amb el pas de selecció de la mida d’aquest manual del producte. Si hi ha desviació, la raó pot ser que les perles magnètiques no estiguin equilibrades a la temperatura ambient o no estiguin completament barrejades, la pipeta no sigui precisa o el líquid es quedi a la punta. Es recomana utilitzar els consells amb baixa adsorció per a l'experiment.

4. Selecció d'adaptadors en la construcció de biblioteques

El kit de construcció de la biblioteca no conté reactiu adaptador i es recomana utilitzar aquest kit juntament amb l’adaptador d’índex únic TIANSeq (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC de la biblioteca

Detecció quantitativa de la biblioteca: Qubit i qPCR s’utilitzen per determinar la concentració de massa i la concentració molar de la biblioteca, respectivament. L'operació s'ajusta estrictament al manual del producte. La concentració de la biblioteca generalment complirà els requisits de la seqüenciació de NGS. Detecció del rang de distribució de la biblioteca: mitjançant Agilent 2100 Bioanalyzer per detectar el rang de distribució de la biblioteca.

6. Selecció del nombre de cicle d'amplificació

Segons les instruccions, el nombre de cicles de PCR és de 6 a 12 i el nombre de cicles de PCR necessaris s’ha de seleccionar d’acord amb l’entrada de mostra. En les biblioteques d’alt rendiment, la sobreamplificació sol produir-se en diversos graus, cosa que es manifesta per un pic una mica més gran després del pic del rang objectiu en la detecció del Bioanalitzador Agilent 2100, o la concentració detectada de Qubit és inferior a la de qPCR. L’amplificació lleu és un fenomen normal, que no afecta la seqüenciació de la biblioteca i l’anàlisi de dades posterior.

7. Spikes apareix al perfil de detecció d’Agilent 2100 Bioanalyzer

L’aparició de pics a la detecció del bioanalitzador Agilent 2100 es deu a la fragmentació desigual de les mostres, on hi haurà més fragments de certa mida, i això es farà més evident després de l’enriquiment de PCR. En aquest cas, es recomana no realitzar la selecció de mida, és a dir, establir la condició de fragmentació a 94 ° C durant 15 min incubats, on la distribució del fragment és petita i concentrada i es pot millorar l’homogeneïtat.